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小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞的磁珠分選

更新時(shí)間:2024-06-24      點(diǎn)擊次數(shù):2174

一、制備脾臟單細(xì)胞懸液

8周齡C57BL/6小鼠摘眼球放血,無菌分離脾臟,于70um濾網(wǎng)上研磨收集脾細(xì)胞,過濾、離心,再以RPMI-1640FD培養(yǎng)液重懸。

二、磁珠標(biāo)記

1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)為8×107/mL。

2. 400×g離心4分鐘,去除上清。

3.每107個(gè)細(xì)胞總量使用40μL緩沖液重懸。

4.每107個(gè)細(xì)胞總量添加10μL CD8+T細(xì)胞生物素抗體混合物。

5.混勻,4℃孵育 5分鐘。

6.每107個(gè)細(xì)胞加入2mL緩沖液洗滌細(xì)胞,400×g離心4分鐘,去上清。

7.每107個(gè)細(xì)胞添加80μL 緩沖液。

8.每107個(gè)細(xì)胞添加20μL抗生物素磁珠。

9.混勻,4℃孵育 10分鐘。

三、磁珠細(xì)胞分選  

1. 將LS分選柱置于相對(duì)應(yīng)的分選器中。

2. 用適當(dāng)體積的緩沖液潤(rùn)洗分選柱.

3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至分選柱中,收集含有未標(biāo)記細(xì)胞的流出液,即 CD8+T細(xì)胞。

4. 加適量的緩沖液,收集總流出物,并與步驟3中的流出液混合,這CD8+T細(xì)胞。

四、流式鑒定

1. 將磁珠分選后得到的CD8+T細(xì)胞懸液離心,400 ×g4min,棄去上清。

2. 細(xì)胞沉淀中加入1 mLFD培養(yǎng)基,計(jì)數(shù)。

3. 從中取出兩份細(xì)胞(一份大概1×106個(gè)細(xì)胞),設(shè)置為blankCD8+T染色組。

4. CD8+T染色組加入200 μL流式染色緩沖液,再加入5 μL Anti-Mo CD8a,吹打均勻,常溫避光孵育15min

5. 孵育結(jié)束后,PBS洗滌細(xì)胞,離心去上清;

6. 加入200 μL流式染色緩沖液,上機(jī)檢測(cè)。


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