流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

1。實(shí)驗(yàn)原理  

     用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染細(xì)胞核。PI在一定波長的光下發(fā)出熒光，其強(qiáng)度與DNA含量成正比。通過流式細(xì)胞儀分析各時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，可檢測細(xì)胞的增殖、凋亡。

2。流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞周期步驟  

     收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以(1~5)×105/孔接種于6孔板，置37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。次日更換培養(yǎng)液，各孔分別加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同濃度茶氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL/孔，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；每24 h同法換液一次。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。  48 h后，中止培養(yǎng)，胰酶消化后，收集細(xì)胞于流式管1000 r/min離心5min，棄上，冷PBS洗滌細(xì)胞3次，離心去上清；  一邊震蕩一邊向細(xì)胞沉淀中加入70%預(yù)冷乙醇混勻，4℃固定18 h以上；離心，棄去乙醇上清，加入預(yù)冷的PBS洗沉淀1次，離心去上清；  加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震蕩混勻。室溫、避光反應(yīng)30 min；  流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測，用Modifit軟件分析各時(shí)相細(xì)胞周期的比例。